کلونینگ، بیان و تخلیص ترانس گلوتامیناز 2 نوترکیب (tg2) و تعیین خصوصیات آمیلوژنیک آن در شرایط آزمایشگاهی

ترانس گلوتامیناز بافتی (ttg) عضوی از خانواده ترانس گلوتامیناز ها بوده که تشکیل باند ایزوپپتیدی را کاتالیز می کنند.. در برخی از بیماری های زوال اعصاب مانند آلزایمر، هانتیگتون و پارکینسون نیز افزایش میزان بیان این پروتئین گزارش شده است. در بیماران مبتلا به پارکینسون، باند ایزوپپتیدی حاصل از کاتالیز آنزیمی در اجسام لووی مشاهده شده است. در مغز بیماران مبتلا به آلزایمر ، در پلاک های سنیل علاوه بر حضور پروتئین ttg فعالیت آنزیمی آن نیز مشاهده شده است. بر مبنای اطلاعات ما، تا کنون هیچ گزارشی بر روی خصوصیات آمیلوژنیک پروتئین ttg گزارش نشده است. در این بررسی قصد داشتیم خصوصیات آمیلوژنیک پروتئین ttg را در vitro بررسی کنیم. بدین منظور، در ابتدا مطالعات بیوانفورماتیک را به منظور شناسایی مناطق آمیلوژنیک در پروتئین با استفاده از برنامه های آن لاین انجام دادیم. جهت بدست آوردن پروتئین tg2 نوترکیب، cdna ژن tg2 توسط pcr تکثیر شد و در وکتور بیانی pet 28a کلون گردید. شرایط مختلف جهت ایجاد تشکیل فیبریل مانند تغییرات دما و ph، یون های فلزی و عوامل شلوغ کننده مختلف بررسی گردید. اجسام سلولی حاوی پروتئین نوترکیب جداسازی شد و با استفاده از شیب اوره روی ستون کروماتوگرافی تمایلی تخلیص گردید؛ فعالیت آنزیماتیک پروتئین نوترکیب تخلیص شده اندازه گیری شد و پروتئین نوترکیب تخلیص شده جهت بررسی شرایط تشکیل آمیلوئید مورد استفاده قرار گرفت. روش های مختلف شامل آزمایش اتصال تیوفلاوین t، شکست نور کنگورد و طیف cd واتصال ans استفاده گردید. نتایج ما بر این موضوع دلالت داشت که غلظت های فیزیولوژیک کلسیم می تواند باعث القای تشکیل آمیلوئید در tg2 می گردد. این موضوع توضیح می دهد که کلسیم می تواند باعث کنفورماسیون خاصی در tg2 شود که اجازه تشکیل آمیلوئید را در شرایط مورد استفاده ما می دهد.